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Humboldt-Universitaet zu Berlin - Collaborative Research Center for Theoretical Biology

Modellierung von Signalkaskaden am Beispiel der RAS-Signalkette

Ras-Signalketten koppeln unterschiedliche extrazelluläre Reize mit dem genetischen Programm von Säugerzellen. Als Folge der Stimulierung von Tyrosinkinase-Rezeptoren durch extrazelluläre Wachstumsfaktoren oder intrinsischer aktivierender Mutationen werden Ras-Signalketten transient bzw. premanent aktiviert und steuern diverse Prozesse bei der Kontrolle der Proliferation, des Zellüberlebens und der Differenzierung. Die mathematische Modellierung dieser Signalketten ist relevant für die Beantwortung genereller Fragen wie Schalterverhalten, Bistabilität, Rückkopplung, kombinatorische Blance, Signalspezifität und Cross-Talk, nicht zuletzt wegen der erheblichen klinischen Bedeutung der onkogen aktivierten Ras-Signaltransduktion bei Krebserkrankungen. Für den Erfolg und die Relevanz der Signalketten-Simulation ist jedoch die Identifizierung und Manipulation experimentell belastbarer Parameterwerte essentiell.

In der vergangenen Förderperiode wurden neben der Implementierung mathematischer Modelle die experimentellen Grundlagen für Simulation auf der Basis experimentell bestätigter Parameter geschaffen. Wir etablierten eine Ratten-Fibroblastenmodell mit konditional expremierbarem Ras-Onkogen. Dieses System erlaubt es u.a., die direkten Auswirkugnen der Signaltransduktion auf das genetische Programm zu untersuchen sowie den Einfluss von Rückkopplungen durch Phosphatasen oder andere Signaleffektoren zu analysieren. Auf Grundlage genomweiter Expressionsprofile Ras-transformierter Zellen stellten wir einen Oligonukleotid-Microarray zusammen, welcher die wichtigsten, auf Ras-Signalketten reagierenden Zielgene repräsentiert. Wir können damit die Veränderungen der mRNA-Spiegel der Zielgene zeitaufgelöst nach Stimulation sowie nach Entfernung des Stimulus messen. Unmittelbare und verzögerte Stimulationen der Genaktivität sowie auch Reduktionen der Genaktivität können parallel sichtbar gemacht werden. Über den Beobachtungszeitraum folgen die mRNA-Speigel einiger Zielgene (u.a. Phosphatasen) offenbar einer komplexen Kinetik. Auf der Ebene der Signaleffektoren ergibt sich als Folge einer pulsartigen Ras-Stimulierung eine reproduzierbare oszillatorische Zeitdynamik der phosphorylierten Effektorkinase Erk (P-Erk). Des weiteren haben wir die Bedingungen für die effiziente Abschalting der Expression von Signaleffektoren und Zielgenen mittels transienter RNA-Interferenz (RNAi) etabliert. Dies erlaubt es, den Beitrag einzelner Isoformen der Signalkinasen der Raf-Familie, der Mitogen-aktiverten Proteinkinasen sowie ausgewählter Ras-Zielgene (z.B. Fra-1) in Signalleitung und Genexpressionskontrolle zu messen undgleichzeitig die Auswirkungen auf zelluläre Eigenschaften zu ermitteln.

In der kommenden Förderperiode sollen drei miteinander verknüpfte Fragestellungen im Mittelpunkt stehen:
1. Zeigen die Signalkaskaden Schalterverhalten oder Bistabilität?
2. Wie induzieren negative Rückkopplungen eine komplexe Aktivierungsdynamik?
3. Wie werden durch die Netzwerkstruktur Entscheidungsbalancen realisiert?

Eine wesentliche Verbesserung der Modelle erwarten wir in Zukunft von Einzelzelluntersuchungen. Darin soll die Dynamik der Signaleffektoraktivierung mittels semi-quantitativer Immunfluoreszenz nach Stimulation der Kette durch Wachstumsfaktoren oder konditional exprimiertes Ras-Protein gemessen werden, um Ultrasensitivität, Bistabilität und Oszillationsverhalten zusätzlich zu den in Zellpopulationen erfassbaren Mittelwerten zu bestimmen (Kooperation mit den Teilprojekten A4, B1, C3).

Die gemessenen dynamischen Veränderungen (Oszillationen) an phosphorylierten (aktiven) Signalkinasen sowie an Phosphatasen sollen durch Modelle reproduziert werden. Im Modell sollen Stimulationsdauer und –stärke variiert und anschließend sollen die Resultate experimentell überprüft werden. Zur Verfeinerung der Analytik Ras-responsiver Zielgene sollen Promotorkonstrukte eingesetzt werden. Analyse und Auswahl der Promotoren aufgrund von vorhergesagten Bindungsstellen für regulatorische Moleküle erfolgen in Zusammenarbeit mit Teilprojekt A1. Außerdem sind Reporterkonstrukt aus Teilprojekt A4 verfügbar.

Beschreibung der ersten Periode
Beschreibung der aktuellen Periode